Định lượng protein: so sánh Bradford, BCA, Lowry và UV280 — chọn phương pháp phù hợp
Định lượng protein: so sánh Bradford, BCA, Lowry và UV280 — chọn phương pháp phù hợp
Định lượng protein tổng (total protein quantification) là bước đầu tiên trong gần như mọi quy trình sinh học phân tử: tinh sạch enzyme, chuẩn bị mẫu Western blot, ELISA, phân tích protein trị liệu, kiểm soát chất lượng vaccine. Mỗi phương pháp có nguyên lý, dải tuyến tính, tương thích chất nền và sai số khác nhau. Chọn sai method dẫn đến kết quả sai lệch 20–50% và ảnh hưởng nghiêm trọng đến downstream.
UV280 — phương pháp trực tiếp dựa trên hấp thụ tia tử ngoại
UV280 đo độ hấp thụ tại 280 nm do các axit amin thơm (Trp, Tyr, Phe) gây ra. Đây là phương pháp không phá hủy mẫu, không cần thuốc thử, đo trong vài giây bằng spectrophotometer hoặc NanoDrop. Hệ số hấp thụ phụ thuộc thành phần amino acid (ε280 của BSA ≈ 0.66 L/g·cm). Nhược điểm: nhạy với nucleic acid (260 nm), detergent có vòng thơm, dải nồng độ giới hạn 0.1–5 mg/mL.
Bradford — Coomassie Brilliant Blue G-250
Coomassie G-250 liên kết với arginine và residue kỵ nước, chuyển từ màu đỏ-nâu (465 nm) sang xanh (595 nm). Bradford nhanh (5 phút), nhạy, tương thích với reducing agent (DTT, β-mercaptoethanol) nhưng không tương thích detergent (SDS, Triton X-100 >0.1%). Phụ thuộc thành phần amino acid (IgG cho tín hiệu thấp hơn BSA ~50%).
BCA — bicinchoninic acid
Protein khử Cu²⁺ thành Cu¹⁺ trong môi trường kiềm; Cu¹⁺ tạo phức màu tím với BCA, hấp thụ tại 562 nm. BCA tương thích tốt với detergent (SDS, Triton tới 5%) nhưng nhạy với reducing agent (DTT, cysteine, glucose). Dải tuyến tính rộng (20–2000 µg/mL với Standard Assay, 0.5–20 µg/mL với Micro BCA). Cần ủ 30 phút ở 37 °C hoặc 2 giờ ở RT.
Lowry — Folin-Ciocalteu
Phương pháp cổ điển (1951), gồm 2 bước: protein-Cu complex (như BCA) sau đó khử Folin-Ciocalteu reagent (phosphomolybdotungstate) tạo màu xanh đo tại 750 nm. Lowry nhạy hơn Bradford nhưng nhiều bước, tốn thời gian (45–60 phút), nhiều chất gây nhiễu (đường, phenol, citrate, Tris >0.1 M).
Bảng so sánh chi tiết 4 phương pháp
| Tiêu chí | UV280 | Bradford | BCA | Lowry |
|---|---|---|---|---|
| Bước sóng đo | 280 nm | 595 nm | 562 nm | 750 nm |
| Dải tuyến tính (µg/mL) | 100-5000 | 1-1500 (micro: 0.5-50) | 20-2000 (micro: 0.5-20) | 2-1500 |
| Thời gian ủ | Không | 5 phút | 30 phút (37°C) | 45 phút |
| Phá hủy mẫu | Không | Có | Có | Có |
| Tương thích detergent | Trung bình | Kém | Tốt (≤5%) | Trung bình |
| Tương thích reducing agent | Tốt | Tốt | Kém (DTT, β-ME) | Trung bình |
| Tương thích chelator (EDTA) | Tốt | Tốt | Kém | Kém |
| Phụ thuộc amino acid | Cao (Trp, Tyr) | Cao (Arg) | Thấp | Thấp |
| Chi phí/test | Rất thấp | Thấp | Trung bình | Trung bình |
| Nhiễu nucleic acid | Cao | Thấp | Thấp | Trung bình |
Hướng dẫn chọn method theo ứng dụng
| Ứng dụng / mẫu | Method khuyến nghị | Lý do |
|---|---|---|
| Protein tinh sạch (chromatography fraction) | UV280 hoặc Bradford | Nhanh, tiết kiệm mẫu |
| Lysate tế bào có SDS/Triton | BCA | Tương thích detergent |
| Lysate có DTT/β-ME | Bradford | BCA bị nhiễu |
| Sample yêu cầu độ chính xác cao (QC) | BCA + Bradford (cross-check) | Hai nguyên lý độc lập |
| Protein trị liệu (mAb) | UV280 (a280 method) | Theo USP <1057> |
| Mẫu vi lượng (<1 µg) | Micro BCA hoặc Qubit fluorescent | Độ nhạy cao |
| Mẫu chứa peptide ngắn | Lowry hoặc BCA | Bradford không nhạy với peptide |
Lưu ý kỹ thuật khi định lượng protein
- Chuẩn (standard): ưu tiên dùng protein cùng họ với mẫu (IgG cho kháng thể, BSA cho mẫu chung). Lập đường chuẩn 5–7 điểm, R² ≥ 0.99.
- Triplicate: mỗi mẫu đo 3 lần, CV <5% mới chấp nhận.
- Blank matching: blank phải chứa toàn bộ thành phần đệm để loại trừ nhiễu nền.
- Pha loãng mẫu: nếu OD vượt dải tuyến tính, pha loãng và đo lại — không ngoại suy ngoài đường chuẩn.
- Microplate reader vs cuvette: microplate (96-well) tiết kiệm mẫu (25–200 µL), thông lượng cao; cuvette cho độ chính xác cao hơn ở nồng độ thấp.
Thiết bị đo cần thiết
| Thiết bị | Ứng dụng | Hãng phổ biến |
|---|---|---|
| UV-Vis spectrophotometer cuvette | UV280, Bradford, BCA, Lowry | Shimadzu UV-1900i, Thermo Genesys |
| Microvolume spectrophotometer | UV280 trên 1–2 µL | Thermo NanoDrop One, Implen NanoPhotometer |
| Microplate reader | Bradford/BCA/Lowry 96-well | BioTek Synergy, Tecan Infinite, Thermo Multiskan |
| Fluorometer | Qubit, Quant-iT | Thermo Qubit 4 |
FAQ
Tại sao Bradford cho kết quả khác BCA trên cùng mẫu?
Vì Bradford phụ thuộc arginine và residue kỵ nước; BCA dựa trên liên kết peptide. Sự khác biệt có thể tới 30% giữa các protein. Luôn dùng cùng chuẩn (BSA hoặc IgG) khi so sánh giữa lab.
UV280 chính xác đến đâu cho mAb?
Rất chính xác nếu biết ε280 lý thuyết (tính từ trình tự amino acid bằng ExPASy ProtParam). Sai số <2% với mAb tinh khiết. USP <1057> chấp nhận UV280 là phương pháp chuẩn cho protein trị liệu.
Có thể đo protein trong môi trường có Tween 20 không?
BCA tốt nhất (chịu Tween đến 5%). Bradford không phù hợp. UV280 bị nhiễu nhẹ nếu nồng độ Tween cao.
Qubit có thay thế được BCA không?
Qubit (huỳnh quang) nhạy hơn 10–100 lần, ít bị nhiễu hơn nhưng chi phí cao gấp 5–10 lần và yêu cầu fluorometer chuyên dụng. Dùng Qubit cho mẫu hiếm/quý; BCA cho QC thường quy.
HTVLAB có cung cấp kit và thiết bị đo protein không?
Có. HTVLAB phân phối spectrophotometer Shimadzu, microplate reader BioTek/Tecan, NanoDrop và kit Bradford/BCA của Thermo Pierce, Bio-Rad.
CTA
Cần tư vấn lựa chọn thiết bị và kit định lượng protein? Liên hệ HTVLAB: Hotline 0909.860.489 | Email sales@htvsci.com.