Pha động trong HPLC: Phân loại, cách pha và lưu ý quan trọng
Tìm hiểu cách chọn, pha chế và bảo quản pha động trong sắc ký HPLC.
Pha động (mobile phase) là yếu tố quyết định trực tiếp đến hiệu quả tách, độ nhạy và tuổi thọ cột trong hệ thống HPLC. Việc lựa chọn đúng loại dung môi, pha chế chính xác tỷ lệ và xử lý đúng quy trình sẽ giúp tối ưu kết quả phân tích, giảm nhiễu đường nền và kéo dài tuổi thọ thiết bị.
Bài viết này cung cấp kiến thức toàn diện về pha động HPLC: từ phân loại, tiêu chí chọn dung môi, đến quy trình pha chế và bảo quản theo chuẩn phòng thí nghiệm.
Pha động HPLC là gì?
Pha động (mobile phase) là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi được bơm liên tục qua cột sắc ký để mang các chất phân tích (analyte) di chuyển qua pha tĩnh. Tương tác giữa analyte với pha động và pha tĩnh tạo ra sự khác biệt về thời gian lưu (retention time), từ đó tách các thành phần trong hỗn hợp mẫu.
Trong hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), pha động đóng vai trò:
- Vận chuyển mẫu qua cột sắc ký
- Điều chỉnh selectivity – thay đổi thứ tự rửa giải các chất
- Ảnh hưởng độ nhạy detector – đặc biệt với detector UV-Vis và DAD
- Quyết định áp suất hệ thống – độ nhớt dung môi ảnh hưởng trực tiếp đến backpressure
Phân loại pha động theo chế độ rửa giải
Chế độ Isocratic (đẳng dòng)
Thành phần pha động không đổi trong suốt quá trình phân tích. Phù hợp cho mẫu có số lượng thành phần ít, thời gian lưu tương đối gần nhau.
- Ưu điểm: Đơn giản, ổn định đường nền, dễ tái lập
- Nhược điểm: Không hiệu quả khi phân tích mẫu phức tạp có dải phân cực rộng
Chế độ Gradient
Thành phần pha động thay đổi theo chương trình (ví dụ: tăng dần tỷ lệ dung môi hữu cơ từ 10% đến 90% trong 30 phút). Phù hợp cho mẫu phức tạp.
- Ưu điểm: Tách tốt hơn các chất có tính chất khác biệt lớn, rút ngắn thời gian phân tích
- Nhược điểm: Cần bơm gradient, thời gian cân bằng lại cột lâu hơn
| Tiêu chí | Isocratic | Gradient |
|---|---|---|
| Độ phức tạp mẫu | Đơn giản (≤5 thành phần) | Phức tạp (>5 thành phần) |
| Thời gian phân tích | Có thể dài nếu dải k' rộng | Ngắn hơn cho mẫu phức tạp |
| Thiết bị yêu cầu | Bơm đơn kênh | Bơm gradient (binary/quaternary) |
| Đường nền | Ổn định | Có thể dao động |
Các dung môi phổ biến trong pha động HPLC
Pha đảo (Reversed-Phase HPLC)
RP-HPLC là chế độ phổ biến nhất, sử dụng cột C18/C8 với pha động phân cực:
| Dung môi | UV cutoff (nm) | Độ nhớt (cP) | Ứng dụng |
|---|---|---|---|
| Nước (HPLC grade) | 190 | 0.89 | Thành phần chính pha đảo |
| Acetonitrile (ACN) | 190 | 0.37 | Ưu tiên số 1 – áp suất thấp |
| Methanol (MeOH) | 205 | 0.54 | Thay thế ACN khi cần selectivity khác |
| Tetrahydrofuran (THF) | 212 | 0.46 | Tách hợp chất vòng thơm |
Pha thuận (Normal-Phase HPLC)
Sử dụng cột silica với pha động không phân cực:
- Hexane – dung môi yếu (UV cutoff: 195 nm)
- Dichloromethane – dung môi trung bình (UV cutoff: 233 nm)
- Ethyl acetate – dung môi mạnh (UV cutoff: 256 nm)
Lưu ý: Tất cả dung môi dùng cho HPLC phải đạt cấp HPLC grade hoặc LC-MS grade.
Chất đệm và phụ gia trong pha động
Pha động thường chứa chất đệm (buffer) và phụ gia để kiểm soát pH và cải thiện hình dạng peak:
| Chất đệm | Dải pH | Tương thích MS | Ghi chú |
|---|---|---|---|
| Phosphate buffer | 2.1–3.1 / 6.2–8.2 | Không | Phổ biến nhất cho UV |
| Ammonium formate | 2.7–4.7 | Có | Phù hợp LC-MS |
| Ammonium acetate | 3.8–5.8 | Có | Phù hợp LC-MS |
| TFA | ~2.0 | Hạn chế | Tách peptide/protein |
| Formic acid | 2.7–4.7 | Có | Thay thế TFA cho LC-MS |
Quy tắc: pH pha động nên cách pKa của analyte ít nhất ±2 đơn vị để đảm bảo peak sắc nét và thời gian lưu ổn định.
Quy trình pha chế pha động chuẩn
Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ
- Sử dụng bình thủy tinh borosilicate sạch
- Dùng ống đong hoặc bình định mức đã hiệu chuẩn
- Đeo găng tay nitrile để tránh nhiễm tạp
Bước 2: Pha dung dịch đệm
- Cân chính xác muối đệm bằng cân phân tích
- Hoà tan trong nước HPLC grade, chỉnh pH
Bước 3: Lọc pha động
- Lọc qua màng lọc 0.45 µm (hoặc 0.22 µm cho UHPLC)
- Dùng màng nylon cho dung môi hữu cơ, PVDF cho hỗn hợp nước-hữu cơ
Bước 4: Khử khí (Degassing)
- Sử dụng bộ khử khí trực tuyến (online degasser) tích hợp trong hệ HPLC
- Hoặc siêu âm 10-15 phút / sục khí helium
Bước 5: Trộn và ghi nhãn
- Trộn theo tỷ lệ %v/v, rót dung môi tỷ trọng cao trước
- Ghi nhãn: thành phần, tỷ lệ, pH, ngày pha, người pha
Lưu ý quan trọng khi sử dụng pha động
1. Tương thích dung môi
Không trộn trực tiếp dung môi không tương thích (ví dụ: hexane với nước). Khi chuyển đổi giữa pha thuận và pha đảo, phải rửa cột qua dung môi trung gian như isopropanol.
2. Thời hạn sử dụng
- Pha động có đệm: Sử dụng trong 48-72 giờ
- Pha động hữu cơ thuần: Có thể dùng đến 1 tuần nếu đậy kín
- Pha động chứa TFA/formic acid: Pha mới mỗi ngày
3. Bảo quản
- Đậy kín bình chứa để tránh bay hơi và hấp thụ CO₂
- Bảo quản nơi thoáng mát, tránh ánh sáng
- Lưu trữ dung môi dễ cháy trong tủ đựng hoá chất chuyên dụng
4. Kiểm soát chất lượng
- Chạy blank injection trước khi phân tích mẫu
- So sánh thời gian lưu chất chuẩn giữa các mẻ pha động
- Ghi chép đầy đủ theo yêu cầu ISO 17025
Xử lý sự cố thường gặp liên quan pha động
| Sự cố | Nguyên nhân | Khắc phục |
|---|---|---|
| Áp suất tăng bất thường | Pha động chưa lọc | Lọc lại qua màng 0.22 µm |
| Đường nền dao động | Bọt khí, dung môi hết hạn | Khử khí kỹ, pha mới |
| Thời gian lưu trôi | pH thay đổi, tỷ lệ sai | Kiểm tra pH, pha lại |
| Peak bị tailing | pH không phù hợp | Điều chỉnh pH pha động |
| Ghost peaks | Dung môi nhiễm tạp | Dùng dung môi mới, rửa bình |
Câu hỏi thường gặp (FAQ)
Acetonitrile hay Methanol tốt hơn cho HPLC?
ACN thường được ưu tiên vì UV cutoff thấp hơn (190 nm), độ nhớt thấp và khả năng rửa giải mạnh. MeOH phù hợp khi cần selectivity khác hoặc phân tích ở bước sóng >210 nm.
Tại sao phải lọc và khử khí pha động?
Hạt bụi gây tắc cột và tăng áp suất. Bọt khí trong flow cell gây nhiễu đường nền, ảnh hưởng độ chính xác.
Pha động HPLC grade khác gì AR grade?
HPLC grade kiểm soát chặt gradient test, fluorescence, UV absorbance và hạt bụi. AR grade chỉ kiểm soát tạp chất hoá học.
Có thể tái sử dụng pha động không?
Không khuyến khích do nguy cơ nhiễm chéo (carry-over) từ analyte đã tách.
Khi nào nên dùng gradient thay vì isocratic?
Khi mẫu có >5 thành phần với dải phân cực rộng, hoặc isocratic không tách hoàn toàn trong thời gian hợp lý.
Cần tư vấn dung môi & vật tư HPLC?
HTVLAB cung cấp đầy đủ dung môi HPLC grade, LC-MS grade, màng lọc và phụ kiện sắc ký từ các hãng uy tín.
Liên hệ tư vấn →